PubescenosideA共价修饰K [复制链接]

Keap1是E3泛素连接酶的重要伴侣蛋白。Keap1有5个域:NTR、BTB、IVR、Kelch(DGR)和CTR域。半胱氨酸在Keap1功能的开关中起重要作用;例如，Cys、Cys和Cys被公认为Keap1的关键半胱氨酸。Keap1有几个伴侣，如p53诱导的死亡结构域蛋白(PIDD)、核因子红样2相关因子2(Nrf2)和p62。BTB结构域和Kelch结构域可以调控Nrf2的泛素化和降解。核因子红样2相关因子2(Nrf2)是一种转录因子，对氧化还原电位敏感。诱导多种抗氧化蛋白和抗氧化剂抑制活性氧(ROS)。最近的研究表明，一些小分子可以修饰这些半胱氨酸，影响Keap1和Nrf2的相互作用。然而，由于这些分子对半胱氨酸的激活和选择尚不清楚，因此很少被临床试验评估。

心肌梗死是世界范围内心血管疾病相关死亡的主要原因。再灌注是心肌梗死公认的治疗方法。然而，由于心肌缺血-再灌注(MI/R)引发氧化应激和炎症，使损伤加重，再灌注有时会使梗死面积增大。NLRP3炎症小体控制白细胞介素-1(IL-1)和IL-18的诱导。有趣的是，在MI/R动物模型中，NLPR3炎性小体的抑制可降低心肌梗死的大小，改善不良的心脏重构，并改善心脏功能。过量的ROS可触发NLRP3炎症小体的激活。ROS清除剂或NADPH氧化酶的下调可抑制NLRP3炎症小体。因此，修饰Keap1上的半胱氨酸以影响nrf2相关的抗氧化信号通路可能改善NLRP3炎性体相关的心肌缺血再灌注。

在中医治疗中，pubescens被广泛用于治疗心血管疾病。我们之前的研究表明，pubescenosideA(PBA)是I.pubescens的活性化合物，具有抗血栓形成和抗炎作用。然而，MI/R损伤的潜在机制和直接靶点仍不清楚。

在AMI/R早期，可以在内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞中检测到NLRP3炎性小体斑点。当炎症细胞浸润心脏时，在巨噬细胞中可以发现NLRP3的主要炎性小体斑点。此外，心肌细胞损伤是AMI/R的主要特征，在氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤心肌细胞中NLRP3炎性小体活化已被证实为。因此，我们选择心肌细胞和巨噬细胞作为代表性细胞类型进行研究。在本研究中，我们首次发现PBA在体外对心肌细胞的氧糖剥夺和再灌注损伤有保护作用，在体内对心肌缺血/再灌注损伤有明显改善作用。此外，PBA可以抑制NLRP3炎症小体的激活。重要的是，我们的结果表明，PBA可以共价结合Keap1的保守Cys77和Cys残基，干扰Cul3-Keap1泛素连接酶复合物和Keap1-Nrf2复合物的相互作用，进而激活Nrf2信号通路。我们的研究结果表明，PBA可能作为一种先导化合物用于发现治疗MI/R损伤的新治疗药物。

1.PBA对心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用

首先通过体外实验验证PBA对H9c2细胞和原代心肌细胞中建立OGD/R模型具有保护作用。接下来，使用诱导的LAD小鼠心肌缺血-再灌注模型来检测PBA的心脏保护作用。30mg/kg剂量的PBA可以显著降低心肌缺血再灌注引起的心肌梗死面积和CK-MB水平(图1D-F)。PBA可以通过增加LVEF、LVFS、+dp/dtmax和-dp/dtmax、降低LVESD和LVSV来改善心功能(图1G-M)。HE染色显示AMI/R破坏了肌原纤维结构，导致中性粒细胞/巨噬细胞簇积累。30mg/kg剂量的PBA不仅保留了肌原纤维结构，还减少了炎症细胞的聚集(图1N)。

2.PBA抑制巨噬细胞、OGD/R诱导的H9c2细胞和原代心肌细胞中NLRP3炎性小体的激活

为了评估PBA对NLRP3炎症小体的影响，我们首先使用已建立的方法(LPS+ATP)在RAW.7细胞中诱导NLRP3炎症小体。为了证实PBA介导的NLRP3炎症小体在心肌缺血-再灌注中的作用，将H9c2细胞和原代心肌细胞暴露于OGD条件下(6小时或3小时)，然后再灌注(18小时)，显著提高了NLRP3、裂解-caspase1和成熟IL-1的低表达水平。然而，PBA以剂量依赖的方式显著抑制OGD/r诱导的心肌细胞炎症小体激活(图2B-C)。此外，如图2D所示，PBA也减弱了AMI/r损伤小鼠心脏组织中NLRP3炎症小体的激活。

3.PBA激活Nrf2通路，诱导保护酶

ROS在NLRP3炎症小体的激活中发挥重要作用。我们发现PBA可以显著抑制LPS+atp诱导的巨噬细胞ROS和OGD/r诱导的H9c2细胞ROS(图3A)。为了探究PBA介导的ROS减少的机制，我们测定了PBA对Nrf2核易位的影响。PBA显著促进Nrf2转位进入细胞核(图3B)。此外，如图3C所示，在OGD/R条件下，PBA强烈诱导心肌细胞Nrf2表达。Nrf2作为转录因子，诱导一组抗氧化酶的表达，如血红素氧合酶-1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)。如图3D所示，在RAW.7和H9c2细胞中，PBA在蛋白水平上增加了HO-1和NQO1的表达，且呈剂量依赖性。另外，为了研究PBA的心脏保护作用是否与Nrf2相关，我们使用Nrf2特异性小干扰RNA敲除Nrf2的表达。图4A的结果显示，Nrf2siRNA转染后，H9c2细胞对OGD/r诱导的损伤更敏感。此外，在Nrf2敲低的H9c2细胞中，PBA的心脏保护作用被阻断。与体外研究结果一致，PBA对AMI/R损伤Nrf2-/-小鼠的心脏保护作用消失。具体来说，在Nrf2-/-小鼠AMI/R损伤情况下，阻断了PBA对CK-MB水平的降低作用以及对-dp/dtmax和-dp/dtmax的增加作用(图4B-E)。图4F的HE染色显示，Nrf2-/-小鼠给予PBA不能抑制炎症细胞浸润，改善紊乱的肌原纤维结构。这些数据表明Nrf2参与了PBA的心脏保护和nlrp3抑制作用。

4.PBA直接作用于Keap1的Cys77和Cys

Keap1是一种富含半胱氨酸的蛋白，通过半胱氨酸诱导的构象变化负调控Nrf2的激活。Co-IP结果显示，PBA显著干扰Keap1和Nrf2的复合物。为了评估PBA是否能直接与细胞内Keap1结合进而影响Nrf2活性，我们使用PBA偶联Sepharose4B珠进行下拉实验。图5A的结果显示，Keap1可以与PBA-Sepharose4Bbeads结合。从大肠杆菌BL21细胞中纯化重组人Keap1进行进一步分析。发现Cys、Cys77、Cys23、Cys38、Cys和Cys处的PBA共价修饰(图5C)。这六种半胱氨酸的共价修饰同样可以起到灭活Keap1的作用。因此，我们将这些半胱氨酸残基分别突变为丝氨酸残基，以确定哪些残基是与PBA结合必不可少的。如图5D所示，Cys、Cys77、Cys23、Cys38等突变体失去了与PBA的结合能力，而其他突变体则保持了对PBA的高结合亲和力。考虑到Cys23和Cys38位于Keap1的NTR区域，对Nrf2不可能有作用，我们推测Cys77和Cys这两个关键残基基在其与PBA相互作用调节Nrf2信号通路中是不可或缺的。

5.Keap1及其突变体与PBA相互作用的热力学分析

半胱氨酸是蛋白质中必需的氨基酸，其官能团-SH是活性中心的关键元素。半胱氨酸是Keap1功能的开关，我们证明了从草药中提取的化合物PBA可以与Keap1中的6种关键半胱氨酸相互作用。但其结合方式的具体机制，特别是与不同半胱氨酸结合顺序的选择尚不清楚。从图7A-H所示的ITC结果(表1)中，我们发现基于结合常数，PBA对半胱氨酸有不同的偏好。根据ITC测定，PBA与Keap1在半胱氨酸上的结合顺序如下:CysCys77Cys23Cys38CysCys(图7I)，与图5D的下拉实验结果一致。此外，我们构建了双突变体Cys77S/CysS,Kd为38.6M，比WT弱约15倍，这些结果有力地支持了PBA优先结合Cys77和Cys的观点。

通过共价对接揭示了PBA与Keap1-Kelch和Keap1-BTB结构域的结合模式对接的分值范围从-4.到-5.Keap1-BTBKeap1-Kelch和-1.到-4.,共价对接Cys和Cys77形成共价键。

综上所述，本研究为PBA通过抑制NLRP3炎症小体的激活改善心肌缺血再灌注损伤提供了初步证据。我们还发现PBA可以修饰Keap1的Cys77和Cys残基，调控Nrf2泛素化和转位到细胞核，进而减轻心肌缺血-再灌注损伤。此外，PBA对Keap1的半胱氨酸有不同程度的激活:Cys77CysCys23Cys38CysCys，这让我们对Keap1的半胱氨酸敏感性有了更深入的了解。